Cromatografía
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Cromatografía [| krəʊmə | tɒgrəfi] (de griego χρῶμα croma "color" y graphein γράφειν "escribir") es el término colectivo para un conjunto de técnicas de laboratorio para el separación de mezclas. La mezcla se disuelve en un líquido llamado la fase móvil, que lleva a través de una estructura que sostiene otro material llamado la fase estacionaria. Los diversos constituyentes de la mezcla de los viajes a velocidades diferentes, haciendo que se separen. La separación se basa en la partición diferencial entre las fases móvil y estacionaria. Sutiles diferencias en un compuesto de partición coeficiente del resultado en la retención diferencial en la fase estacionaria y cambiando así la separación.
La cromatografía puede ser preparativa o analítica. El propósito de la cromatografía preparativa es separar los componentes de una mezcla para un uso más avanzado (y es así una forma de la purificación). Cromatografía analítica se hace normalmente con cantidades más pequeñas de material y es para la medición de las proporciones relativas de analitos en una mezcla. Los dos no son mutuamente excluyentes.
Historia
Cromatografía, literalmente "escritura de color", fue empleado por primera vez por el científico ruso Mijail Tsvet en 1900. Él continuó trabajando con cromatografía en la primera década del siglo 20, principalmente para la separación de las plantas pigmentos tales como clorofila, carotenos, y xantofilas. Dado que estos componentes tienen diferentes colores (verde, naranja y amarillo, respectivamente) que dio la técnica de su nombre. Los nuevos tipos de cromatografía desarrollados durante los años 1930 y 1940 hicieron la técnica útil para muchos procesos de separación.
Técnica de cromatografía desarrollado sustancialmente como resultado del trabajo de Archer John Porter Martin y Richard Laurence Millington Synge durante los años 1940 y 1950. Ellos establecieron los principios y técnicas básicas de la cromatografía de reparto, y su trabajo alentó el rápido desarrollo de varios métodos cromatográficos: cromatografía en papel, cromatografía de gases, y lo que se conocería como de alto rendimiento de cromatografía líquida. Desde entonces, la tecnología ha avanzado rápidamente. Los investigadores encontraron que los principales principios de la cromatografía de Tsvet se podrían aplicar de muchas maneras diferentes, dando lugar a las diferentes variedades de cromatografía descritas a continuación. Los avances están mejorando continuamente el rendimiento técnico de cromatografía, lo que permite la separación de moléculas cada vez más similares.
Términos Cromatografía
- El analito es la sustancia que ser separados durante la cromatografía.
- Cromatografía analítica se utiliza para determinar la existencia y, posiblemente, también la concentración de analito (s) en una muestra.
- Una fase unida es una fase estacionaria que está unido covalentemente a las partículas de soporte o a la pared interior del tubo de columna.
- Un cromatograma es la salida visual del cromatógrafo. En el caso de una separación óptima, diferentes picos o patrones en el cromatograma corresponden a diferentes componentes de la mezcla separada.
- Traza en el eje x es el tiempo de retención y traza en el eje y una señal (por ejemplo, obtenida por una espectrofotómetro, espectrómetro de masas o una variedad de otros detectores) correspondiente a la respuesta creado por los analitos que salen del sistema. En el caso de un sistema óptimo de la señal es proporcional a la concentración del analito específico separado.
- Un cromatógrafo es un equipo que permite una separación por ejemplo, cromatografía de gases sofisticados o separación por cromatografía líquida.
- La cromatografía es un método físico de separación que distribuye componentes se separen entre dos fases, una estacionaria (fase estacionaria), mientras que la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección definida.
- El eluato es la fase móvil sale de la columna.
- El eluyente es el disolvente que lleva el analito.
- Una serie eluotrópica es una lista de disolventes clasificados según su poder de elución.
- Una fase inmovilizada es una fase estacionaria que está inmovilizado sobre las partículas de soporte, o en la pared interior del tubo de columna.
- La fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un líquido (LC y electrocromatografía capilar (CEC)), un gas (GC), o un fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos, SFC). La fase móvil consiste en la muestra que está siendo separada / analizado y el disolvente que se mueve la muestra a través de la columna. En el caso de HPLC la fase móvil consiste en un disolvente no polar (s) tal como hexano en fase normal o en disolventes polares de cromatografía de fase inversa y la muestra se separó. La fase móvil se mueve a través de la columna de cromatografía (la fase estacionaria) donde la muestra interactúa con la fase estacionaria y se separa.
- La cromatografía preparativa se utiliza para purificar cantidades suficientes de una sustancia para su uso posterior, en lugar de análisis.
- El tiempo de retención es el tiempo característico necesario para que un analito particular para pasar a través del sistema (desde la entrada de la columna al detector) bajo determinadas condiciones. Ver también: Índice de retención de Kovats '
- La muestra es el asunto analizado en cromatografía. Se puede consistir en un solo componente o puede ser una mezcla de componentes. Cuando la muestra se trata en el curso de un análisis, la fase o las fases que contienen los analitos de interés es / son referidos como la muestra mientras que todo lo que fuera de interés separado de la muestra antes de o en el curso del análisis se refiere como residuos.
- El soluto se refiere a los componentes de la muestra en la cromatografía de partición.
- El disolvente se refiere a cualquier sustancia capaz de solubilizar otra sustancia, y especialmente la fase móvil líquida en cromatografía líquida.
- La fase estacionaria es la sustancia fijo en su lugar durante el procedimiento de cromatografía. Los ejemplos incluyen la sílice de capa en la cromatografía en capa fina
La cromatografía se basa en el concepto de coeficiente de partición. Cualquier partición del soluto entre dos disolventes inmiscibles. Cuando hacemos una inmóvil disolvente (por adsorción sobre una matriz de soporte sólido) y otro móvil que resulta en aplicaciones más comunes de cromatografía. Si el soporte de matriz es polar (por ejemplo, papel, sílice, etc.) es hacia adelante cromatografía de fase, y si es no polar (C-18) es de fase inversa.
Técnicas de forma lecho cromatográfico
La cromatografía en columna
La cromatografía en columna es una técnica de separación en la que el lecho estacionario está dentro de un tubo. Las partículas de la fase estacionaria sólida o el soporte recubierto con una fase estacionaria líquida pueden llenar todo el volumen interior del tubo (columna rellena) o ser concentrado en oa lo largo de la pared del tubo interior dejando un camino abierto, sin restricciones para la fase móvil en la parte media del tubo (columna tubular abierto). Las diferencias en las tasas de movimiento a través del medio se calculan a diferentes tiempos de retención de la muestra.
En 1978, WC Aún introdujo una versión modificada de la cromatografía de columna llamada cromatografía en columna de flash (flash). La técnica es muy similar a la cromatografía en columna tradicional, a excepción de que el disolvente es impulsado a través de la columna mediante la aplicación de presión positiva. Esto permitió que la mayoría de las separaciones que se deben realizar en menos de 20 minutos, con la mejora de las separaciones en comparación con el método antiguo. Sistemas de cromatografía flash modernos se venden como cartuchos de plástico preenvasados, y el disolvente se bombea a través del cartucho. Los sistemas también pueden estar relacionados con detectores y colectores de fracciones proporcionando automatización. La introducción de bombas de gradiente resultó en separaciones más rápidas y el uso menos solvente.
En adsorción de lecho expandido, se utiliza un lecho fluidizado, en lugar de una fase sólida hecha por un lecho empaquetado. Esto permite omisión de las etapas iniciales de compensación tales como la centrifugación y la filtración, para caldos de cultivo o suspensiones de células rotas.
Cromatografía de fosfocelulosa utiliza la afinidad de unión de muchas proteínas de unión al ADN de fosfocelulosa. Cuanto más fuerte es la interacción de una proteína con el ADN, mayor será la concentración de sal necesaria para eluir esa proteína.
Cromatografía planar
Cromatografía planar es una técnica de separación en la que la fase estacionaria está presente como o en un avión. El avión puede ser un papel, que sirve como tal o impregnado por una sustancia como el lecho estacionario ( la cromatografía en papel) o una capa de partículas sólidas repartidas sobre un soporte tal como una placa de vidrio ( cromatografía en capa fina). Diferentes compuestos en la mezcla de muestra viajan distancias diferentes de acuerdo a cómo interactúan fuertemente con la fase estacionaria en comparación con la fase móvil. La específica Factor de retención (R f) de cada producto químico se puede utilizar para ayudar en la identificación de una sustancia desconocida.
La cromatografía en papel
La cromatografía en papel es una técnica que consiste en colocar un pequeño punto o línea de solución de muestra sobre una tira de papel de cromatografía. El papel se coloca en un frasco que contiene una capa superficial de disolvente y sellado. Como disolvente se eleva a través del papel, que cumple con la mezcla de muestra, que comienza a viajar hasta el papel con el disolvente. Este papel está hecho de celulosa, una sustancia polar, y los compuestos dentro de la mezcla de viajes más si son no polar. Más sustancias polares vínculo con el papel de celulosa más rápidamente, y por lo tanto no viajar tan lejos.
Cromatografía en capa fina
Cromatografía de capa fina (TLC) es una técnica de laboratorio empleado ampliamente y es similar a cromatografía en papel. Sin embargo, en lugar de usar una fase estacionaria de papel, se trata de una fase estacionaria de una fina capa de adsorbente como gel de sílice, alúmina , o de celulosa sobre una superficie plana, inerte sustrato. En comparación con el papel, que tiene la ventaja de carreras más rápidas, mejores separaciones, y la posibilidad de elegir entre diferentes adsorbentes. Para mejor resolución y que permita una cuantificación, de alto rendimiento TLC se puede utilizar.
Cromatografía de desplazamiento
El principio básico de cromatografía de desplazamiento es: una molécula con una alta afinidad por la matriz de cromatografía (el desplazador) compite efectivamente por los sitios de unión, y por lo tanto desplazar todas las moléculas con afinidades menores. Hay diferencias distintivas entre el desplazamiento y la cromatografía de elución. En el modo de elución, sustancias típicamente emergen de una columna en, picos gaussianos estrechas. Amplia separación de picos, preferiblemente a la línea de base, se desea para la purificación máxima. La velocidad a la que cualquier componente de una mezcla viaja por la columna en modo de elución depende de muchos factores. Pero para ser resueltos dos sustancias para viajar a diferentes velocidades, y de este modo, tiene que haber diferencias sustanciales en algún tipo de interacción entre las moléculas biológicas y de la matriz de cromatografía. Los parámetros de funcionamiento se ajustan para maximizar el efecto de esta diferencia. En muchos casos, la separación de línea de base de los picos sólo puede lograrse con elución en gradiente y las cargas de columna de baja. Por lo tanto, dos inconvenientes a cromatografía modo de elución, especialmente en la escala preparativa, son la complejidad operativa, debido al bombeo de gradiente de disolvente, y de bajo rendimiento, debido a las cargas de columna de baja. Cromatografía de desplazamiento tiene ventajas sobre cromatografía de elución en que los componentes se resuelven en zonas consecutivas de las sustancias puras en lugar de "picos". Debido a que el proceso de toma ventaja de la no linealidad de las isotermas, una alimentación de la columna más grande puede ser separado en una columna dada con los componentes purificados recuperados en concentraciones significativamente más altas.
Técnicas por el estado físico de la fase móvil
La cromatografía de gases
La cromatografía de gases (GC), a veces también conocida como cromatografía de gas-líquido, (GLC), es una técnica de separación en la que la fase móvil es un gas. La cromatografía de gases siempre se lleva a cabo en una columna, que es típicamente "envasado" o "capilar" (ver más abajo).
La cromatografía de gases se basa en una equilibrio de reparto de analito entre una fase sólida estacionaria (a menudo un material a base de silicona líquida) y un gas móvil (lo más a menudo helio). La fase estacionaria se adhiere a la parte interior de un tubo de vidrio de diámetro pequeño (una columna capilar) o una matriz sólida dentro de un tubo de metal más grande (una columna empaquetada). Es ampliamente utilizado en química analítica ; aunque las altas temperaturas usadas en GC lo hacen inadecuado para biopolímeros de elevado peso molecular o proteínas (calor desnaturaliza ellos), que se encuentran frecuentemente en bioquímica , que es muy adecuado para su uso en el petroquímica, vigilancia del medio ambiente y remediación, y campos químicos industriales. También se utiliza ampliamente en la investigación química.
La cromatografía líquida
La cromatografía líquida (LC) es una técnica de separación en la que la fase móvil es un líquido. La cromatografía líquida se puede llevar a cabo en una columna o un avión. Cromatografía líquida de día presente, que generalmente utiliza partículas muy pequeñas de embalaje y una presión relativamente alta se conoce como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
En HPLC la muestra es forzada por un líquido a alta presión (fase móvil) a través de una columna que está repleto de una fase estacionaria compuesta de partículas de forma irregular o esférica, una capa monolítica porosa, o una membrana porosa. HPLC se divide históricamente en dos sub-clases diferentes en función de la polaridad de las fases móviles y estacionarios. Métodos en los que la fase estacionaria es más polar que la fase móvil (por ejemplo, tolueno como fase móvil, sílice como la fase estacionaria) se denominan cromatografía líquida en fase normal, (NPLC) y el opuesto (por ejemplo, mezcla de metanol-agua como el móvil fase y C18 = octadecilsililo como la fase estacionaria) se denomina invierten cromatografía líquida de fase (RPLC). Irónicamente la "fase normal" tiene menos aplicaciones y por lo tanto RPLC se utiliza mucho más.
Las técnicas específicas bajo este amplio título se enumeran a continuación.
La cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad se basa en selectiva interacción no covalente entre un analito y moléculas específicas. Es muy específico, pero no es muy robusta. A menudo se utiliza en bioquímica en la purificación de proteínas unidas a las etiquetas. Estos proteínas de fusión están etiquetados con compuestos tales como Sus etiquetas, biotina o antígenos, que se unen a la fase estacionaria específicamente. Después de la purificación, algunas de estas etiquetas suelen ser eliminado y se obtiene la proteína pura.
La cromatografía de afinidad a menudo utiliza la afinidad de una biomolécula por un metal (Zn, Cu, Fe, etc.). Las columnas se preparan a menudo manualmente. Columnas de afinidad tradicionales se utilizan como un paso preparativa para eliminar las biomoléculas no deseadas.
Sin embargo, existen técnicas de HPLC que utiliza cromatografía sobre propiedades de afinidad. Immobilized metal cromatografía de afinidad (IMAC) es útil para separar moléculas mencionadas anteriormente sobre la base de la afinidad relativa para el metal (Ie Dionex IMAC). A menudo, estas columnas pueden ser cargados con diferentes metales para crear una columna con una afinidad específica.
Cromatografía de fluidos supercríticos
Cromatografía de fluido supercrítico es una técnica de separación en la que la fase móvil es un fluido por encima y relativamente cerca de su temperatura y presión crítica.
Técnicas de mecanismo de separación
Cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de intercambio iónico (normalmente conocida como cromatografía iónica) utiliza un mecanismo de intercambio de iones para separar los analitos en función de sus respectivos cargos. Por lo general, se realiza en columnas pero también puede ser útil en el modo planar. Cromatografía de intercambio iónico utiliza una fase estacionaria cargada para separar compuestos cargados incluyendo aniones , cationes , aminoácidos , péptidos y proteínas . En los métodos convencionales de la fase estacionaria es una resina de intercambio iónico que lleva cargada grupos funcionales que interactúan con los grupos de carga opuesta del compuesto de retener. Cromatografía de intercambio iónico se utiliza comúnmente para purificar proteínas utilizando FPLC.
Cromatografía de exclusión por tamaño
Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se conoce también como cromatografía de permeación en gel (GPC) o cromatografía de filtración en gel y separa las moléculas según su tamaño (o más exactamente de acuerdo a su diámetro hidrodinámico o el volumen hidrodinámico). Las moléculas más pequeñas son capaces de entrar en los poros de los medios de comunicación y, por lo tanto, las moléculas son atrapados y se retira del flujo de la fase móvil. El tiempo de residencia medio en los poros depende del tamaño eficaz de las moléculas de analito. Sin embargo, las moléculas que son más grandes que el tamaño medio de los poros de la empaquetadura están excluidos y por lo tanto sufren esencialmente no retención; tales especies son las primeras en ser eluida. En general, es una técnica de cromatografía de baja resolución y por lo tanto a menudo se reserva para el paso final, "pulido" de una purificación. También es útil para determinar la estructura terciaria y estructura cuaternaria de las proteínas purificadas, especialmente ya que puede llevarse a cabo bajo nativas solución condiciones.
Ampliado de adsorción de lecho (EBA) Separación cromatográfica
Ampliado lecho de adsorción (EBA) Separación cromatográfica captura una proteína diana a partir de una corriente de alimentación crudo cuando pasa a través de un sistema de columna de cromatografía que contiene perlas adsorbentes. Con esta técnica, la carga de crudo puede ser tratada directamente en la columna cromatográfica, evitando los pasos de clarificación y pre-tratamiento tradicionales. EBA Separación cromatográfica es altamente escalable, de columnas de diámetro de 1 cm en laboratorio a grandes columnas de producción de hasta 2 metros de diámetro. Estas columnas típicamente pueden manejar material de alimentación rendimiento de más de 1.000.000 litros por día, con una capacidad de producción de 1.000 proteínas TM por año.
Técnicas especiales
Cromatografía en fase inversa
Cromatografía de fase inversa es un procedimiento de elución utilizado en la cromatografía de líquido en el que la fase móvil es significativamente más polar que la fase estacionaria.
Cromatografía bidimensional
En algunos casos, la química dentro de una columna dada puede ser insuficiente para separar algunos analitos. Es posible dirigir una serie de picos no resueltos en una segunda columna con diferente físico-química ( Clasificación química) propiedades. Dado que el mecanismo de retención en este nuevo soporte sólido es diferente de la primera separación dimensional, puede ser posible separar compuestos que son indistinguibles por cromatografía unidimensional. La muestra se mancha en una esquina de una placa cuadrada, desarrollado, secado al aire, a continuación, gira 90 ° y por lo general reconstruido en un segundo sistema de disolvente.
Cromatografía de lecho móvil simulado
Cromatografía de gases de pirólisis
La pirólisis espectrometría de masas de cromatografía de gases es un método de análisis químico en el que la muestra se calienta hasta la descomposición para producir moléculas más pequeñas que están separados por cromatografía de gases y detectado usando espectrometría de masas.
La pirólisis es la descomposición térmica de los materiales en una atmósfera inerte o un vacío. La muestra se pone en contacto directo con un alambre de platino, o se coloca en un tubo de muestra de cuarzo, y se calienta rápidamente a 600-1000 ° C. Dependiendo de la aplicación se utilizan temperaturas aún más elevadas. Tres técnicas diferentes de calefacción se utilizan en pirolizadores reales: horno isotérmico, calentamiento inductivo (Curie Point filamento) y calefacción utilizando resistivas filamentos de platino. Las moléculas grandes se pegan en sus puntos más débiles y producen, fragmentos más volátiles de menor tamaño. Estos fragmentos pueden ser separados por cromatografía de gases. Cromatogramas GC de pirólisis son típicamente compleja porque se forma una amplia gama de diferentes productos de descomposición. Los datos se pueden utilizar como huellas dactilares para comprobar la identidad material o de la / MS datos de GC se utiliza para identificar fragmentos individuales para obtener información estructural. Para aumentar la volatilidad de los fragmentos polares, diversos reactivos de metilación se pueden añadir a una muestra antes de la pirólisis.
Además del uso de pirolizadores dedicados, pirólisis GC de muestras sólidas y líquidas se puede realizar directamente en el interior de temperatura programable vaporizador (PTV) inyectores que proporcionan un calentamiento rápido (hasta 30 ° C / s) y las altas temperaturas máximas de 600-650 ° C. Esto es suficiente para algunas aplicaciones de pirólisis. La principal ventaja es que ningún instrumento dedicado tiene que ser comprado y pirólisis se puede realizar como parte del análisis de GC de rutina. En este caso GC de cuarzo revestimientos de entrada tienen que ser utilizados. Los datos cuantitativos pueden ser adquiridos, y los buenos resultados de la derivación en el interior del inyector de PTV se publican también.
Cromatografía líquida rápida de proteínas
Cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) es un término aplicado a varias técnicas de cromatografía que se utilizan para purificar proteínas. Muchas de estas técnicas son idénticas a las realizadas en virtud de cromatografía líquida de alto rendimiento, sin embargo el uso de técnicas de FPLC son típicamente para la preparación de lotes a gran escala de un producto purificado.
Cromatografía Contracorriente
Cromatografía en contracorriente (CCC) es un tipo de cromatografía líquido-líquido, en donde las fases estacionarias y móviles son líquidos. El principio de funcionamiento de los equipos CCC requiere una columna que consiste en un tubo abierto enrollado alrededor de una bobina. La bobina se gira en un movimiento giratorio de doble eje (A cardioide), lo que provoca un campo de gravedad variable (G) para actuar en la columna durante cada rotación. Este movimiento hace que la columna para ver un paso de partición por revolución y componentes de la muestra separada en la columna debido a su coeficiente de partición entre las dos fases líquidas inmiscibles utilizadas. Hay muchos tipos de CCC disponibles en la actualidad. Estos incluyen HSCCC (CCC alta velocidad) y HPCCC (CCC Alto Rendimiento). HPCCC es la última y mejor versión realización de la instrumentación disponible en la actualidad.
La cromatografía quiral
La cromatografía quiral implica la separación de estereoisómeros. En el caso de enantiómeros, éstos no tienen diferencias químicas o físicas aparte de ser imágenes especulares tridimensionales. Cromatografía convencional u otros procesos de separación son incapaces de separar de ellos. Para habilitar separaciones quirales a tener lugar, ya sea la fase móvil o de la fase estacionaria deben a su vez hacerse quiral dando diferentes afinidades entre los analitos. Columnas de HPLC quiral (cromatografía con una fase estacionaria quiral) en fase normal y reversa están disponibles comercialmente.
